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Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 4337 (2022) Citer cet article

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Une correction de l'éditeur à cet article a été publiée le 13 octobre 2022.

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Nous rapportons un candidat vaccin vivant atténué contre le SRAS-CoV-2 avec (i) des séquences régulatrices de transcription virale repensées et (ii) des cadres de lecture ouverts (ORF) supprimés 3, 6, 7 et 8 (∆3678). Le virus ∆3678 se réplique environ 7 500 fois moins que le SRAS-CoV-2 de type sauvage sur des cultures primaires de voies respiratoires humaines, mais rétablit sa réplication sur des cellules Vero-E6 déficientes en interféron qui sont approuvées pour la production de vaccins. Le virus ∆3678 est fortement atténué dans les modèles de hamster et de souris K18-hACE2. Une immunisation à dose unique contre le virus ∆3678 protège les hamsters contre la provocation et la transmission du virus de type sauvage. Parmi les ORF supprimés dans le virus ∆3678, ORF3a représente la plus grande atténuation en antagonisant la phosphorylation de STAT1 au cours de la signalisation de l'interféron de type I. Nous avons également développé un virus rapporteur mNeonGreen ∆3678 pour la neutralisation à haut débit et les tests antiviraux. Dans l’ensemble, les résultats suggèrent que le ∆3678 SARS-CoV-2 pourrait servir de candidat vaccin vivant atténué et d’outil de recherche pour une utilisation potentielle de niveau 2 de biosécurité.

La pandémie de COVID-19, causée par le SRAS-CoV-2, a entraîné plus de 513 millions d’infections confirmées et 6,2 millions de décès (au 1er mai 2022 ; https://coronavirus.jhu.edu/). Différentes plates-formes vaccinales ont été développées avec succès pour le COVID-19, notamment l’ARNm, le vecteur viral, la protéine sous-unitaire et le virus inactivé. Les vaccins vivants atténués contre le SRAS-CoV-2 n’ont pas été activement explorés, même s’ils peuvent présenter les avantages d’un faible coût, d’une forte immunogénicité et d’une durabilité immunitaire potentiellement longue1. Le virion du SRAS-CoV-2 se compose d'une nucléocapside interne, formée par l'ARN génomique recouvert de protéines de nucléocapside (N), et d'une enveloppe externe, formée par une membrane bilipide d'origine cellulaire incrustée d'une pointe (S), d'une membrane (M) , et les protéines d'enveloppe (E)2. Le génome de l'ARN viral simple brin de sens positif code pour les cadres de lecture ouverts (ORF) pour seize protéines non structurelles qui forment la machinerie de réplication (ORF1a/ORF1b), quatre protéines structurelles (S, E, M et N) et sept protéines accessoires3. Bien que les fonctions exactes des protéines accessoires du SRAS-CoV-2 restent à déterminer, des études antérieures sur d'autres coronavirus suggèrent que ces protéines ne sont pas essentielles à la réplication virale mais peuvent moduler la réplication et la pathogenèse en interagissant avec les voies de l'hôte4,5,6,7, 8. Ainsi, la suppression des protéines accessoires pourrait être utilisée pour atténuer le SRAS-CoV-2.

Les coronavirus répliquent et transcrivent les ARN subgénomiques (sgRNA) via un mécanisme de transcription discontinu médié par des séquences régulatrices de transcription (TRS). Les TRS sont des séquences nucléotidiques conservées situées près de l'extrémité 5' du génome et aux extrémités 5' des ORF en aval (Fig. 1a). Ces TRS régulent la transcription via un appariement de bases entre le TRS leader et les TRS du corps, ce qui conduit à la production de sgARN, qui traduisent les ORF en aval9,10,11. Au sein du TRS, une séquence centrale de 6 à 8 nucléotides guide la formation des paires de bases entre l'ARN naissant et le TRS leader. Il a été démontré précédemment que le recâblage de la séquence guide du réseau SARS-CoV TRS pourrait produire un virus atténué. Un tel SARS-CoV mutant TRS pourrait servir d’approche vaccinale vivante atténuée pour minimiser le risque de réversion12,13.

un schéma de principe pour la construction de Δ678 et Δ3678 SARS-CoV-2. Les délétions ont été introduites dans le squelette de la souche USA-WA1/2020. Les cases vertes et rouges indiquent respectivement les séquences TRS originales et mutées. T7 Promoteur T7, séquence leader L, séquences régulatrices de transcription TRS ; Cadre de lecture ouvert ORF, gène de glycoprotéine d'enveloppe E, gène de glycoprotéine membranaire M, gène de nucléocapside N, région non traduite UTR, queues pA poly A. b Morphologies de plaques des virus recombinants WT, Δ678 et Δ3678. Des tests de plaque ont été effectués sur des cellules Vero-E6 et colorés 2,5 jours après l'infection. c – e Cinétique de réplication des SARS-CoV-2 WT, Δ678 et Δ3678 sur les cellules Vero-E6 (c), Calu-3 (d) et HAE (e). Les virus WT, Δ678 et Δ3678 ont été inoculés sur des cellules Vero-E6, Calu-3 et HAE à des MOI de 0,01, 0,1 et 2, respectivement. Après une incubation de 2 heures, les cellules ont été lavées trois fois avec du DPBS et cultivées en continu sous du FBS DMEM frais à 2%. Les surnageants de culture ont été mesurés pour déterminer les titres de virus infectieux à l'aide de tests de plages sur des cellules Vero-E6. f Niveaux intracellulaires d'ARN WT, Δ678 et Δ3678 dans les cellules AOH au jour 7 après l'infection. Les cellules HAE ont été lavées avec du PDBS trois fois, lysées avec du Trizol pour l'isolement de l'ARN, quantifiées pour les ARN viraux par RT-qPCR. c – f Les points représentent des répétitions biologiques individuelles (n = 3 pour Vero-E6 et Calu-3 ; n = 5 pour HAE). Les valeurs du graphique représentent la moyenne ± écart type. Un test t bilatéral non apparié a été utilisé pour déterminer les différences significatives entre les groupes WT et Δ678/Δ3678. Les valeurs P ont été ajustées à l'aide de la correction de Bonferroni pour tenir compte de comparaisons multiples. Les différences étaient considérées comme significatives si p < 0,025. g de cellules AOH mNG-positives après infection par le virus mNG WT ou mNG Δ3678 à une MOI de 0,5. Des images représentatives de cellules mNG-positives provenant de trois expériences indépendantes sont présentées ; la faible résolution des images mNG-positives était due au fait que la culture HAE était constituée de cellules vivantes multicouches sur un insert en plastique placé dans des plaques à 6 puits. Barre d'échelle, 100 µm. c–f Les données sources sont fournies sous forme de fichier de données sources.